Cuộc chiến chống Nga của Gustav III và việc ông thực hiện Đạo luật Liên minh và An ninh năm 1789 đã làm gia tăng lòng căm thù đối với nhà vua vốn ngày càng gia tăng trong giới quý tộc kể từ cuộc đảo chính năm 1772. Một âm mưu ám sát nhà vua và cải cách hiến pháp được giới quý tộc ngấm ngầm lên kế hoạch vào mùa đông năm 1791–1792. Trong số những người liên quan có Jacob Johan Anckarström, Adolph Ribbing, Claes Fredrik Horn, Carl Pontus Lilliehorn và Carl Fredrik Pechlin. Anckarström được chọn để thực hiện vụ ám sát bằng súng lục và dao, nhưng cũng có bằng chứng cho thấy Ribbing mới làn người bắn Gustav.[22]

Vụ ám sát nhà vua được thực hiện tại một vũ hội đeo mặt nạ ở Nhà hát Opera Hoàng gia trong kinh đô Stockholm vào lúc nửa đêm ngày 16 tháng 3 năm 1792.[2] Gustav đã đến sớm hơn vào buổi tối hôm đó để thưởng thức bữa tối cùng với bạn bè. Trong bữa tối, nhà vua nhận được một lá thư nặc danh mô tả mối đe dọa đến tính mạng của ông ấy (được viết bởi đại tá của Đội cận vệ nhà vua (Svea Life Guards) Carl Pontus Lilliehorn), nhưng vì nhà vua đã nhận được rất nhiều lá thư đe dọa trong quá khứ nên ông ấy đã chọn phớt lờ nó. Bức thư được viết bằng tiếng Pháp, và trong bản dịch có nói rằng:

Đối với Nhà vua - với sự khiêm tốn lớn nhất.

Xin cầu nguyện, cho phép một người vô danh có ngòi bút được hướng dẫn bởi sự tế nhị và tiếng nói của lương tâm, dám tự do thông báo với Ngài, với tất cả sự chân thành có thể, rằng có một số cá nhân tồn tại, cả ở Tỉnh và ở đây trong Thành phố, chỉ biết hít thở sự thù hận và trả thù ngài; thực sự đến mức cực đoan muốn rút ngắn sự sống của ngài, thông qua việc giết người.

Họ rất buồn khi thấy điều này không xảy ra ở lễ hội hóa trang lần trước nhưng họ vui mừng khi biết rằng hôm nay sẽ có lễ hội hóa trang mới. Kẻ cướp không thích đèn lồng; không có gì hữu ích cho một vụ ám sát hơn là bóng tối và ngụy trang. Vì vậy, tôi dám kêu gọi ngài, bằng mọi thứ thánh thiện trên thế giới này, hãy hoãn vũ hội đáng nguyền rủa này, đến những thời điểm tích cực hơn cho lợi ích hiện tại cũng như sắp tới của ngài...[23]

Để thách thức bất kỳ kẻ ám sát nào có thể xảy ra, Nhà vua đi ra ngoài vào một khán đài mở đối diện với sân khấu opera. Và sau khoảng mười phút, ông ấy nói đây sẽ là một cơ hội để bắn. Nào, chúng ta đi xuống. Quả bóng dường như vui vẻ và tươi sáng. Nhà vua nắm cánh tay phải của Nam tước Hans Henrik von Essen đi vòng quanh nhà hát một vòng rồi vào tiền sảnh nơi họ gặp Đại úy Carl Fredrik Pollet.[24]

Nhà vua, von Essen và Pollet tiếp tục đi qua một hành lang dẫn từ tiền sảnh đến sân khấu opera, nơi diễn ra buổi khiêu vũ. Trên sân khấu, một số người đàn ông đeo mặt nạ - một số nhân chứng đã nói về 20 hoặc 30 người đàn ông - khiến nhà vua không thể tiếp tục. Do đám đông, Pollet lùi lại phía sau Nhà vua, người đang cúi người về phía sau để nói chuyện với Pollet.[25]

Anckarström đứng với Ribbing bên cạnh ở lối vào hành lang, tay trái cầm một con dao và mang một khẩu súng lục ở túi trong bên trái và một khẩu súng lục khác ở túi sau bên phải. Họ tiến ra phía sau Nhà vua, Anckarström lấy khẩu súng lục từ túi trong bên trái của mình và Ribbing hoặc anh ta bóp cò bằng khẩu súng trên tay Anckarström. Do nhà vua quay ngược lại nên viên đạn đi theo một góc từ đốt sống thắt lưng thứ ba về phía vùng hông.[26]

Nhà vua co giật và nói "aee" mà không ngã. Anckarström sau đó mất hết can đảm, đánh rơi khẩu súng lục và con dao và hét lên. Những người thuộc đội cận vệ của nhà vua đứng cách đó vài mét. Khi đến chỗ Nhà vua, họ nghe thấy ông ấy nói bằng tiếng Pháp “Aï, je suis phướcé” (Ouch, tôi bị thương).

Nhà vua được đưa trở lại nơi ở của mình, và các lối ra của Nhà hát Opera đã bị phong tỏa. Anckarström bị bắt vào sáng hôm sau và ngay lập tức thú nhận tội ám sát, mặc dù anh ta phủ nhận âm mưu cho đến khi được thông báo rằng Horn và Ribbing cũng đã bị bắt và đã thú nhận toàn bộ.[25]

Nhà vua không bị bắn chết; ông còn sống và tiếp tục giữ chức vụ nguyên thủ quốc gia. Cuộc đảo chính là một thất bại trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, vết thương bị nhiễm trùng và vào ngày 29 tháng 3, nhà vua cuối cùng qua đời với những lời trăng trối:

Vết thương do đạn bắn của Gustav ban đầu không được coi là nguy hiểm đến tính mạng; bằng chứng được kiểm tra lại cho thấy rằng chính việc nhiễm trùng nghiêm trọng đột ngột đã giết chết nhà vua gần như ngay lập tức, 13 ngày sau khi ông đã bình phục, có thể là do bác sĩ phẫu thuật Daniel Théel [sv], kẻ thù được biết đến của nhà vua, gây ra bằng phương pháp hóa học.[27]

Ulrica Arfvidsson, nhà tâm linh nổi tiếng của thời đại Gustav, đã nói với nhà vua điều gì đó có thể được hiểu là dự đoán về vụ ám sát vào năm 1786, khi Gustav đến thăm cô ấy một một cách bí mật - một sự trùng hợp ngẫu nhiên - nhưng cô ấy được biết là có một mạng lưới lớn những người cung cấp thông tin ở khắp mọi nơi để giúp cô ấy đưa ra những lời tuyên đoán chuẩn xác hơn, và trên thực tế cô ấy đã bị thẩm vấn về vụ giết người.